本文作者：蘭海云 汪愛勤 尹文 單位：第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學部 第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學部 第四軍醫(yī)大學中心實驗室

在體成像技術的發(fā)展及成像策略的不斷提高，能夠在活的生物體內(nèi)揭示細胞和分子水平的諸多細微變化，有助于在生物整體、真實的體內(nèi)環(huán)境中高時間分辨率地研究生命過程。針對某一生物過程的帶有光學標記的報告基因已被廣泛應用于細胞生物學的研究，近年來正被更多地用于在活的動物模型中探究人體內(nèi)生理機能和疾病的生物學過程。利用熒光蛋白、螢光素酶基因等生物材料標記細胞、病原體和基因，早已被證實是一種在體內(nèi)設置“檢測器”、體外直觀檢測的非常可行的策略[1]。

1在體生物發(fā)光成像技術的原理

通過生物技術將構建的以螢光素酶基因作為標記基因的載體（重組原核表達質(zhì)粒、重組真核表達質(zhì)粒或重組病毒），經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染并篩選得到重組病原菌、細胞（如免疫細胞、腫瘤細胞、胚胎干細胞等）或重組病毒（如腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等）用于轉(zhuǎn)入小動物；或是將含螢光素酶及調(diào)控序列的載體線性化后經(jīng)顯微注射等技術穩(wěn)定整合于小動物基因組制備轉(zhuǎn)基因動物[2－4]。標記基因的表達可通過多種調(diào)控元件進行調(diào)控，如靶基因的啟動子和增強子等；標記的方法因研究領域、研究目的和實驗策略的不同而各異[4]，但最終都是在體內(nèi)組織如血液、肝臟、腦、脾、腎等靶部位因特定生物過程的發(fā)生而伴隨產(chǎn)生有酶活性的螢光素酶。在注入底物即螢光素的條件下，螢光素酶催化底物反應產(chǎn)生特定波長的光信號，通過成像系統(tǒng)可以直觀檢測到光信號的產(chǎn)生及變化，實時反映體內(nèi)發(fā)生的生物過程，如基因的調(diào)控表達、信號傳導、蛋白質(zhì)之間的相互作用、細胞增殖與分化等。因此，在體生物發(fā)光成像技術可廣泛應用于分子生物學、細胞生物學、病毒學與免疫學、腫瘤學等研究領域[5－8]。

2在體生物發(fā)光成像技術的應用

2．1標記于腫瘤細胞、免疫細胞、胚胎干細胞等，轉(zhuǎn)入體內(nèi)后進行成像

螢光素酶基因作為一種報告基因，最初應用于體外培養(yǎng)細胞內(nèi)目的基因的表達研究。在體生物發(fā)光成像技術的發(fā)展，使其能夠應用于在體組織細胞的表達研究[9]。螢光素酶是一類生物發(fā)光酶，1種細胞可同時被2種具有不同底物的螢光素酶標記。例如其一可由一組成性穩(wěn)定表達的啟動子驅(qū)動，作為內(nèi)參，反應細胞數(shù)量的變化；另一螢光素酶由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動，其發(fā)光信號的變化，在消除細胞數(shù)量變化的影響后就可反映特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達活性[10－11]。

2．1．1腫瘤及抗腫瘤研究在體生物發(fā)光成像技術可直接實時地監(jiān)測各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估，能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。Klerk等[12]研究證實了利用此技術測量腫瘤負荷具有很高的可靠性。Minn等[13]應用該技術進行了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關基因的研究，他們構建能夠表達熒光蛋白、螢光素酶的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染已獲得的不同亞群腫瘤細胞，先通過熒光激活細胞分選術篩選同一亞群內(nèi)具有相同轉(zhuǎn)染效果（穩(wěn)定表達外源蛋白即熒光蛋白和螢光素酶，且水平一致）的細胞，并尾靜脈注射免疫缺陷小鼠，通過檢測生物發(fā)光的部位和大小，評價不同亞群腫瘤細胞向肺部位的轉(zhuǎn)移情況及其轉(zhuǎn)移能力，再通過檢測細胞內(nèi)各基因的表達差異來分析肺轉(zhuǎn)移相關基因。Gupta等[15－16]又用相似的方法來研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關基因及乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中分化基因介導的腫瘤再起始，結果再次顯示了生物發(fā)光成像技術應用于腫瘤及癌轉(zhuǎn)移機理研究領域的優(yōu)越性。

2．1．2抗腫瘤免疫及腫瘤細胞疫苗的研究用帶有生物發(fā)光標記基因的小鼠淋巴細胞或基因修飾的腫瘤細胞疫苗，可以檢測放射及化學藥物治療的效果，并可尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復雜的細胞機制。Cayeux等[17]用螢光素酶基因標記基因修飾的腫瘤細胞疫苗來免疫小鼠，而用另一種底物不同于前者的5，6－carboxy－succinimidyl－fluorescein標記該小鼠內(nèi)一種與腫瘤相關的免疫細胞，通過2種不同的標記研究了基因修飾的腫瘤細胞疫苗免疫小鼠后抗原遞呈、免疫細胞之間的相互作用及不同免疫細胞在體內(nèi)免疫過程中的作用。

2．1．3藥物促腫瘤細胞凋亡的研究當螢光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達，產(chǎn)生的融合蛋白無螢光素酶活性，細胞不能發(fā)光，而當細胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase－3在特異識別位點切去抑制多肽，螢光素酶活性得到恢復，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細胞凋亡相關事件。細胞凋亡時被激活的caspase－3／7與DEVD－氨基螢光素（aminoluciferin）特異結合而被酶解為氨基螢光素，它可被螢光素酶識別而產(chǎn)生生物發(fā)光信號。Liu、Hickson等[18－19]利用這一現(xiàn)象設計的細胞凋亡檢測方法均能夠以極低的DEVD－氨基螢光素量獲得較強的發(fā)光強度，因而這一方法可用于評價TNFα（α腫瘤壞死因子）、FasL、TRAIL（TNF相關促凋亡配體）等因素針對腫瘤的治療效果。

2．1．4胚胎干細胞及再生醫(yī)學的研究胚胎干細胞在再生醫(yī)學領域極具應用前景，然而注入活機體的胚胎干細胞及其分化細胞尚存在顯著的細胞死亡、畸胎瘤的形成、宿主免疫排斥反應等障礙。應用在體生物發(fā)光成像技術，可對胚胎干細胞本身及其在注入機體后的存活、增殖、分化等生物事件的發(fā)生機理進行深入研究，從而使上述諸多問題得以解決[20]。

2．2標記病原微生物，用于研究感染致病機制、轉(zhuǎn)移途徑及宿主免疫反應等

在感染性疾病的研究中，在體生物發(fā)光成像技術的應用，不僅可以提供疾病進程中觀測病原體在動物體內(nèi)的寄居部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應等實時變化信息，而且更有助于揭示感染體內(nèi)病原體逃逸宿主防御的機制[21]。對病原體感染過程非侵入性的檢測能夠?qū)膊∵M程實時地提供新的信息，且有可能發(fā)現(xiàn)新的感染位點[22]。Lucker等[23－26］以螢光素酶基因標記HSV－1（單純皰疹病毒）并分別侵染Ⅰ類干擾素受體缺失、Ⅱ類干擾素受體缺失、Ⅰ和Ⅱ類干擾素受體均缺失的小鼠，可觀察到HSV－1對不同干擾素受體缺失小鼠的肝臟、肺、脾、淋巴結的侵襲，及病毒從血液系統(tǒng)進入神經(jīng)系統(tǒng)的過程，從而證實了不同干擾素在HSV－1感染中所起的不同的作用。Lucker等[27]針對痘苗病毒的類似研究也證實，不同干擾素在機體感染過程中各自和協(xié)同發(fā)揮的重要作用。